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今天,我们跟随JOVE一起学习如何进行蛋白纯化

今天要纯化的目的蛋白为MOG,为了纯化这个蛋白,首先将目的蛋白构建到质粒上。并添加相应的tag。

His tag用于镍柱纯化,大家应该很熟悉,这里我们看看其他的几个tag

首先是thioredoxin---

硫氧还蛋白(thioredoxin)作为融合标签可以促进蛋白的可溶性表达。

TEV Protease是一种在大抽杆菌中重组表达的带His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶,能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser,并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切,常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase (GST)、His或者其它标签的蛋白酶。

建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端,并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEV Protease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后,在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基,从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。构建含有TEV Protease专一性识别位点的目的蛋白表达质粒。

第一步 蛋白的诱导表达

  1. 用BL21-MOGtag甘油菌种接种5mlLB培养基(0.1mg氨苄青霉素/ ml),并在37℃孵育过夜,200rpm。

将两个含有500ml无菌LB培养液的1L锥形瓶置于37℃培养箱中备用。

3.将500μl100mg / ml氨苄青霉素加入含有500mlLB的烧瓶中。将1ml来自步骤1.1的过夜培养物添加到两个LB培养瓶中。在37°C和200转/分的条件下孵育5小时,直到光学密度为0.6。

4.从一个烧瓶取一个1毫升等分试样,并将其转移到一个单独的1.5毫升离心管中。将细胞以16,000×g离心1分钟,

去除上清液。将管标记为T0(预诱导),然后将细菌沉淀物放入-20℃的冰箱中以备将来的十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

5.将0.5ml的1M异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入到每个培养瓶中。孵化在37的烧瓶200转/分钟4小时,然后在室温75转/分钟过夜。

第二步 收集细菌

收获MOGtag,首先在Triton X-100缓冲液中裂解细菌,然后超声处理。然后从包涵体中释放MOGtag并用咪唑和胍变性,产生含有MOGtag蛋白的粗蛋白溶液。

从过夜培养物取一个1ml等分试样并将其转移到1.5ml微量离心管中。将细胞以16,000×g离心1分钟并除去上清液。将管子标记为TO / N(诱导后),然后将细菌沉淀放入-20°C冰箱以备将来进行SDSPAGE分析。

2.将培养物均匀分布在兼容高速离心的250ml瓶中,并从这点开始将其保存在冰上。将细菌细胞在4℃下以22,000×g离心15分钟。

3.丢弃上清液。将菌体储存在-20°C或继续步骤。

4.通过加入60μl Triton X-100制备裂解缓冲液(0.1mg / ml鸡蛋溶菌酶,在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.1%Triton-X(v / v))和120μl50mg / ml鸡蛋溶菌酶储备溶液加入到60mL PBS中。

5.将步骤2.3的所有细菌沉淀物重新悬浮并合并在总共30ml的裂解缓冲液中。把这个体系调到50ml的高速离心管。将此管置于30°C水浴中30分钟。在孵化期间,摇动试管两次重悬细胞。

6.孵育后,将试管转移到冰上,并以20kHz,70%振幅,3秒脉冲,3秒脉冲和5秒每轮的脉冲。超声波共六轮,让解决方案之间的冰冷中回合。

7.将溶液在4℃以24,000×g离心15分钟。弃上清,重复步骤2.5-2.7一次。将颗粒储存在-20°C或继续步骤2.8。

8.通过加入0.8766g的NaCl,0.09456g的Tris-HCl和0.01021g的缓冲液A(500mM NaCl,20mM Tris-HCl,5mM咪唑,pH7.9 咪唑加入到100ml烧杯中。加水直至体积达到28ml,然后将溶液的pH调节至7.9。然后,转移到100毫升量筒,加水直到体积为30毫升。

9.在30ml缓冲液A中重悬步骤2.7的沉淀,并将该溶液在4℃下孵育3小时。在此期间,称量17.2克盐酸胍。

10.使用与步骤2.6中相同的设 置在冰上超声处理溶液。然后将17.2克盐酸胍加入到溶液中。在冰上孵化1小时以溶解MOGtag蛋白质。

11.将溶液在4℃以24,000×g离心30分钟。收集上清液并将上清液保存在4°C直到蛋白质纯化。

第三步 蛋白纯化

注意:在以下步骤中,MOGtag蛋白将通过4轮吸附到带电荷的镍树脂上(通过His标签)和洗脱进行纯化。

1.制作以下缓冲液:

1.准备缓冲液B(500mM NaCl,20mM Tris-HCl,5mM咪唑,6M盐酸胍,pH7.9)。加入5.844g NaCl,0.6304g Tris-HCl,0.0681克咪唑和114 64克盐酸胍加入到500毫升烧杯中。然后加水,直到达到190毫升,调节pH值至

7.9。将溶液转移到250毫升量筒中,加入水直到体积为200毫升。

2.准备洗脱缓冲液(500mM NaCl,20mM Tris-HCl,0.5M咪唑,6M盐酸胍,pH7.9)。加入5.844克NaCl,0.6304克Tris-HCl,6.808g咪唑和114.64g盐酸胍加入到500mL烧杯中。加入水,直到达到190毫升,调节pH值至7.9。将溶液转移到250毫升量筒中,加入水直到体积为200毫升。

3.准备带状缓冲液(500mM NaCl,20mM Tris-HCl,100mM EDTA,pH7.9)。加入5.844g NaCl,0.6304g Tris-HCl,40ml 500mM EDTA加入到500mL烧杯中。加水直到达到190毫升,调节pH值到7.9。转移到250毫升

加入水,直到容积达到200毫升。

4.准备电荷缓冲液(0.1M硫酸镍)。向500ml烧杯中加入5.257g硫酸镍,加水至190ml

(注意,在硫酸镍溶于水中之前,不要在通风橱外处理硫酸镍)。一旦硫酸镍溶解,将溶液转移到250毫升量筒中,加入水直到体积达到200毫升。

2.将10ml镍树脂分离到两个离心力超过4,500xg(每管5ml)的锥形50ml离心管之间。

3.charge和平衡镍树脂:

  1. 通过向每个含有树脂的管中加入40ml水来清洗树脂。水平放置在摇杆上,让他们搅拌5分钟在4°C。一旦完成,在4℃下以4,500×g离心8分钟 。

弃去上清液,以避免干扰颗粒。加入40毫升电荷缓冲液到每个管。将管子转移到一个摇杆,让他们在4°C搅拌15分钟。一旦完成,在4℃下以4,500×g离心8分钟。

3.弃去上清,然后加入40毫升缓冲液B到管中。将试管转移到摇杆上,让它们在4℃搅拌5分钟。

一旦完成,在4℃下以4,500×g离心管8分钟,然后丢弃上清液。

4.可选:取150μl步骤2.11中收集的溶解蛋白质,转移至1.5ml微量离心管中。标记管预孵育和冻结在-20°C为今后的SDS页面分析(图3,纯化前MOGtag)。

5.纯化MOGtag蛋白质:

  1. 将来自步骤2.11的全部溶解蛋白质(〜40ml,减去步骤3.4中移除的小样品)转移至第一管。将步骤3.3中的镍树脂混合,并在4℃的水平摇床上放置1小时。

2.在4℃下以4,500×g离心管8分钟。一旦完成,将上清液转移到第二管

镍树脂并按前述步骤进行孵育。同时,用管1继续下面的步骤3至6。

3.用40ml洗脱缓冲液重新悬浮试管1中的镍树脂,并将试管水平放置在4℃摇床上5分钟。然后,在4℃下以4,500×g离心管8分钟。

4.将含有洗脱的MOGtag蛋白质的上清液转移到250ml标记为“纯化的MOGtag蛋白质”的瓶子中,并将该瓶保持在4°C。在每个洗脱步骤中,将得到的上清液收集在该瓶中。

5.向镍树脂中加入40ml带状缓冲液,并在4℃下在水平摇床上放置5分钟。

6.在4℃下以4,500×g离心管8分钟。弃去上清液,然后按步骤3.3中所列的方法重新添加镍树脂。

7.完成后,按照第3.5步中所列的第二个管子向前移动。总共4轮吸收溶解的蛋白质

步骤2.11到带电荷的镍树脂上,洗脱将回收大部分蛋白质,但如果需要的话,可以在额外的吸收和洗脱循环中回收额外的蛋白质。

6.完成四轮(或更多轮)吸收和洗脱后,将收集的纯化蛋白质在4°C过夜储存。镍树脂可以在4°C储存在40毫升的20%乙醇溶液中,直到需要再次使用。

以上三部分,我们主要讲解了 蛋白的诱导培养纯化,明天我们继续 蛋白的复性-定量等内容!!

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